一文解读CDC效应

药物的作用机理一般就是自身发挥作用，或以自身做为媒介，引导其它的起作用，现在的抗体药物也无出其右。当然，由于现在的抗体改造方法的不断出现，很多抗体将这两者综合起来。前者常见的有：

1. 中和/阻断: 占据位点，不让它和别的分子结合。最常见的check point药物就属于这类。

2. 信号传递/程序性死亡: 激活受体分子，引起下游信号传导；或引起抗原交联，或激活死亡受体，从而最终导致细胞自杀。

针对后者，常见的如下：

1. ADC: 抗体分子身上绑着“炸弹”（放射性同位素）或“匕首”（化疗药），识别并结合到肿瘤细胞表面的抗原后，会进入到细胞内部，继而释放武器，杀死肿瘤细胞。

2. ADCP: 抗体分子结合细胞表面的抗原后，通过其Fc部分把巨噬细胞招来，巨噬细胞再把肿瘤细胞或病菌细胞吞噬。

3. ADCC: 抗体分子结合细胞表面的抗原后，通过其Fc部分招来NK细胞，NK细胞再对肿瘤细胞或病菌细胞痛下杀手。

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这次我们来看下CDC这块。

依赖补体的杀伤(CDC)作用机制

补体的活化主要有三类机理，分别是旁路途径，甘露糖结合凝集素途径和经典途径，如下图所示。抗体药物研发比较关注的自然是抗体依赖的经典途径。其主要机制是抗体IgG和IgM的恒定区发挥作用，当其结合于靶细胞表面时，经典的补体途径激活，从而诱导靶细胞表明形成膜攻击复合物(MAC)--“孔洞”，最终使其裂解死亡。

在设计单抗药时，我们往往选择在肿瘤细胞、病菌细胞或病原入侵细胞的表面上过量表达、而在正常细胞中几乎不表达的抗原作为靶点。当IgG抗体的Fab部分结合到这些抗原后，如果满足了一定的条件，这些IgG分子的Fc区域会相互作用、联结。当六个结合了抗原的IgG分子在细胞表面联结成一个环形的六聚体后，这种美丽的“雪花”就成为该细胞的死亡之戳。IgG的Fc上暴露出能结合C1q的位点。C1q是补体系统的第一个蛋白成员，它有六只长臂(gC1q)，分别抓住六个Fc区，并同时携带着一对C1r和一对C1s蛋白酶（C1r2s2）。C1r和C1s开始引发一系列级联反应，其涉及的补体家族成员包括C4,C2,C3,C5,C6,C7,C8和C9。C5b、C6-C9再组装成膜攻击复合体（MAC）。最后MAC会在细胞膜上凿孔，引起细胞裂解。

影响CDC作用因素

清楚地知道影响CDC作用的因素，能够使我们更好的开发实验，目前明确知道以下五点:

1)    抗体亚型。通常来说，IgG3的CDC作用最大，其次是IgG1，IgG2和IgG4极其微弱。利用基因工程在抗体铰链区或恒定区CH2进行氨基酸替换可以增强或减弱CDC作用。

2)    靶细胞抗原的表达水平。过表达抗原的细胞系需要表达足够的抗原来结合抗体和激活补体。抗原表达不足，不能完全激活补体。

3)    靶细胞表面表达其他蛋白。在靶细胞表面表达诸如CD46、CD55和CD59膜蛋白会抑制或减弱CDC作用。补体的激活是级联放大效应，靶细胞表达以上膜蛋白会在不同环节抑制补体的激活。

4)    补体的来源：在血清中存在补体，加入实验体系后能够促进CDC作用。因此我们必须得清楚靶细胞是否与所选择的动物种属血清相匹配。一般来说，我们研究针对人的抗原生产抗体，得到的人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体均需是使用人的血清，兔的血清偶尔也会用到，但临床有意义的数据需使用人的血清。鼠源血清对细胞有毒害且没有CDC作用，因此体外功能实验中很少会用到小鼠血清。

5)    抗体抗原结合方位抗体与抗原的结合方位及相邻抗体的排列方式会显著影响CDC的作用，针对B细胞抗原CD20上市的抗体药物有很多，但他们在CDC作用表现出极大的不同。部分抗体能激活补体，有很强的CDC作用;部分抗体不同激活补体。

检测CDC作用的方法

CDCassay的过程较简单，通常将靶细胞与待测抗体37°孵育，随后加入人血清共同孵育1-24小时，即可检测裂解的死细胞或活细胞。检测的方法较多，如1)荧光染料标记   2)台盼蓝标记   3)LDH检测    4)calcein-AM标记    5)Alamarblue和CellTiter-Blue标记   6)CCK-8    7)51Cr释放实验

比如：

靶细胞在DMEM/F12加10%FBS的培液中培养。实验前一天，收集靶细胞，计数，配制1X105/ml细胞，100μl/孔加入到96孔细胞培养板中。37°C , 5% CO2 孵育过夜备用。
实验当天，移走96-孔板细胞中的培养基，用PBS洗2遍待用。待测抗体用无血清培养基（RPMI 1640）稀释, 抗体起始浓度为20ug/ml , 按 5倍稀释。将50μl/孔稀释抗体加入PBS洗过的靶细胞培养板（0 ug/ml 抗体孔用新鲜培养基100μl/孔, 作为对照孔），各个浓度点设6个复孔。37°C , 5% CO2 孵育15min。
准备补体：取血清于灭菌的离心管中。分取一半血清于56°C水浴锅孵育30分钟灭活补体，作阴性对照。将灭活和没有灭活的血清，分别用RPMI1640培养基配成血清：RPMI 1640培养基= 40%：60%， 即40%为血清， 60%为RPMI 1640。
向含不同浓度待测抗体的靶细胞培养板中加入50μl/孔稀释好的血清，即血清终浓度为20%；样品（抗体）的起始浓度为10ug/ml。前3复孔加入有补体的血清，后3复孔加入灭活补体的血清。37°C , 5% CO2度培养箱孵育2小时进行LDH检测。

食蟹猴/人血清供应

来自食蟹猴的未灭活血清可用于补体依赖性细胞毒性（CDC）测定。CDC 所需的组分蛋白存在于食蟹猴血清中，可用于表达靶抗原的人类靶细胞的CDC检测。因此，人类治疗性抗体可以招募食蟹猴补体蛋白，以促进靶细胞的溶解。

StemExpress®健康人血清严格按照FDA规定进行采集，血清使用分离胶采血管采集，血样正常，无溶血，新鲜采集，未进行热灭活。

参考文献

1)JoseeGolayetal.,(2012)ArchivesofBiochemistryandBiophysics526(146–153)

2)Park,L.Cetal.,(2019).doi:10.1002/ijc.32328

3)MingZhouetal.,(2019)Xenotransplantation.

4)JoséeGolayetal.,(2001)BLOOD,1DECEMBER2001,VOLUME98,NUMBER123383