一文解读DC：最佳的抗原递呈细胞

2019-06-16 17:22 严国樑

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【上一篇聊到了我司的PBMC(一文解读PBMC：药物研发的最佳搭档)，后续我们就围绕着PBMC的家族成员一个一个来介绍，这次先介绍DC细胞，作为最重要的抗原递呈细胞，并且高表达PD-L2，在常见的MLR, Treg抑制，SEB等体外实验中常常能看到它的身影】

树突状细胞（DC）由诺奖得主拉尔夫斯坦曼于1973年在小鼠脾脏中发现，因其细胞膜伸出许多类似于神经细胞的树突故而得名。DC细胞作为最重要的抗原递呈细胞（APC），在先天免疫和适应新免疫中起着重要的桥梁作用。并且随着现在免疫检查点药物的火爆，DC作为激活Naive T
Cell的唯一成员，受到越来越多的关注。

DC的分类

DC其实是一类细胞的统称，可大略分为pDC和mDC。其中mDC根据表面maker的不同又可以分为CD1c（BDCA），CD141(BDCA3)和CD16(FCγRIII)。在体外由Monocyte分化而成的DC也归属于mDC（如Figure1）。其中pDC的形态类似于浆细胞，而且主要通过分泌大量的IFN-α和IFN-β来抵御病毒攻击，与我们传统认为的DC区别较大。因而在本文中，我们仅讨论mDC。

Fig. 1. Preparation of a DC Vaccine in vivo and in vitro.

Dendritic cells differentiate in vivo to form defifined subsets with functional specialisation. These pre-formed DC or monocytes can be purifified directly from the blood using
mAbs and magnetic selection, plate-based adherence, or purifification by density gradients. While pre-formed blood DC need then only to be activated and exposed to antigen,
monocytes need to fifirst be cultured with GM-CSF and IL-4 to form DC prior to activation and antigen exposure. Delivery is then required such that DC can reach the lymph
node, the site where they can optimally prime T cells and generate an anti-tumour response.

DC的激活

在正常组织中，树突状细胞为重量级吞饮者，它们每小时可吸收4倍于其体积的细胞外液。通常，它们仅只是把细胞外液吞饮进去，然后将其吐出细胞外。在这一静息状态，树突状细胞表面表达有一些B7分子和相对低水平的MHC分子。因此，静息态树突状细胞不擅长于提呈抗原至T细胞，尤其不擅长于将抗原提呈至Naive
T细胞——激活Naive
T细胞需要有MHC-多肽复合体及强有力的共刺激信号。

一旦有微生物入侵，树突状细胞定居的组织将成为战场。树突状细胞可以被其它免疫细胞的信号激活，如中性粒和巨噬细胞在吞噬微生物时释放的TNF，或被微生物杀死的其它正常细胞释放的化学物质。同时树突状细胞也可以通过模式识别受体(如Toll样受体)来识别病原相关分子模式的识别分子来激活。

DC的游走

通过上面所述的细胞因子，死亡细胞释放的化学物质，模式识别受体结合或这些信号的共刺激，原先作为“重量级吞饮者”的DC细胞将发生显著的改变。现在DC细胞不再做“吞进吞出”的动作，而是在接下来的将近6个小时内，大量吞噬以获取足量的抗原标本，从而以快照的形式抓拍正在前线发生的事情，随后随着淋巴系统转移到最近的淋巴结。正是这种“一经战斗信号刺激即游走”的能力使得树突状抗原提呈细胞如此特别。

DC的抗原提呈

在静息状态树突状细胞内有大量的 MHCⅡ分子正等候着被装载。当静息树突状细胞被激活时，这些“储备”的 MHCⅡ分子与来自战区的抗原装载。当树突状细胞抵达目的地时，这些装载抗原的MHCⅡ分子被展示于树突状细胞表面。同时在游走过程中，树突状细胞上调MHCⅠ类分子的表达。因而，当树突状细胞在战区被病毒或寄生物感染时，由这些侵袭寄生物产生的蛋白片段可以在淋巴结中由MHCⅠ类分子有效提呈，最后，在游走过程中，树突状细胞也增加B7共刺激蛋白产生。所以，当抵达淋巴结时，游走树突状细胞已具备激活Naive
T细胞所必需的一切条件——高水平的MHCⅠ类和Ⅱ类分子及足够量的B7蛋白。

由于淋巴结是T细胞的聚集点，游走的树突状细胞可以将从战区携带的抗原片段提呈给Naive
T细胞。总而言之，只要战斗还在继续，机体就需要DC游走并提呈抗原。如果感染严重，产生大量的细胞因子，就会有大量的树突状细胞开始迁移。而且，在离开组织之前，树突状细胞产生特殊的细胞因子（亦称趋化因子）来影响前体细胞（单核细胞），使其离开血液，进入组织，且成为树突状细胞。因而，激活的树突状细胞可募集自身替代者。这些新抵达的树突状细胞继而被激活，并被派遣至淋巴结，从而扩大了针对入侵的免疫应答。另一方面，如果攻击相对温和，则战斗性细胞因子的产生相对较少，相应地，也有较少的树突状细胞参与游走，替换补充者也较少。由于在淋巴结中被激活的B细胞和T细胞的数量取决于携带有战斗信息的树突状细胞，因此建立了一个“惩罚措施与犯罪行为相适应”的系统，使免疫应答的强度取决于感染的严重性。一旦激活（免疫学家通常称其为“成熟”）的树突状细胞抵达淋巴结，它们仅存活数天，这保证了由树突状细胞所携带的战斗“信息”总是最新的。

DC的体外诱导

1.按照标准方法复苏冷冻PBMC，并用磁珠法提取CD14细胞；

2.将CD14+细胞浓度调整为0.5million/ml。此浓度可根据您的实际情况进行调整；

3.添加IL4+GM-CSF，在37°C，5%的二氧化碳条件下培养；细胞密度为1–2.5 x 105/ c㎡；培养5天后用于实验；

5.3-4天更换一次培养基，去除一半的培养基，换成等量的新鲜培养基。

6.细胞收集

a) 收集培养基并装入试管中。立即将PBS添加到贴壁细胞中，上下移动移液管冲洗培养皿表面并收集入试管；

b) 向培养皿中加入PBS，并将培养皿置于37°C的培养箱中10-15分钟。在此期间，细胞应开始从培养皿表面脱离。当用相差显微镜观察时，它们变得更圆、更亮。

c) 将PBS中的细胞与a中的细胞混合；

当然对于第一步我们也可以选择使用贴壁法直接获得DC，而不必再去使用CD14磁珠分选，这样得到的DC纯度会低一些，但后续再用LPS或其它激活，纯度会提高。同时这样得到的最终DC含量会高于用磁珠分选，毕竟分选会损耗一批CD14细胞。

针对有些客户认为使用冷冻PBMC分化DC可能不好的问题，其实现阶段完全没有必要担心，已经有大量客户在使用冷冻PBMC分化DC，完全不影响实验结果。

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DC和癌症

肿瘤可以通过一些方式来逃避效应T细胞的杀伤，包括1、现在最火爆的免疫检查点（PD-(L)1，LAG3, TIM-3等）；2.肿瘤特异性新生抗原耐受；3.低免疫原性，包括肿瘤低表达MHC-I分子；4.肿瘤微环境中的免疫逃逸（TAM,MSDS,Treg等）。由于DC作为唯一能够激活Naive T cell并在前天和适应性免疫中起桥梁作用的细胞，在上述的几个常见逃逸机制中都起到重要作用。

谈到树突状细胞与肿瘤，就无法避开“魏则西事件”的DC-CIK，这一事件对整个细胞治疗行业的影响一直持续至今，这段时间才刚刚又有风声要放开收费问题。DC-CIK的原理其实非常简单：首先将患者自己的DC细胞提取出来在体外同患者手术切除的肿瘤组织或肿瘤相关抗原肽进行抚育来诱导DC细胞成熟，同时将患者的淋巴细胞提取出来在体外用细胞因子激活成为CIK细胞（Cytokine Induce Killer cells，主要为CD3和CD56阳性的细胞），然后在体外将肿瘤抗原诱导成熟的DC细胞和CIK细胞共同培养进行肿瘤抗原呈递来激活肿瘤抗原相应的淋巴细胞，再把它们回输给病人体内。归根到底就是在体外环境模拟DC抗原递呈，激活肿瘤特异性T细胞，再将其回输给病人进行治疗。这一方法从原理上能够讲通，但临床试验中疗效一直不佳，基本全部以失败告终，更多的是作为免疫辅助疗法使用。以这种免疫辅助疗法去欺骗绝望的患者并收取高昂费用，最后人人喊打确实也不为过。

第二个跟树突状细胞直接相关的就是树突细胞疫苗，目前树突状细胞肿瘤疫苗正在被迅速、广泛的研究 ,并且已在动物实验和早期的临床实验中取得了很有意义的结果。这些研究结果表明: 树突状细胞肿瘤疫苗不仅能够诱发针对原发肿瘤的免疫应答 , 而且也能够诱发针对转移肿瘤的免疫应答。树突状细胞疫苗基于高度特异全身和局部的细胞免疫重建，因而对癌细胞清除更具靶向性，更精准高效。
同时可持续启动以非溶胞为核心杀伤模式的清除机制，因而安全性高，最后树突状疫苗具有疫苗特性的长期作用，能够实现预防和治疗的有机结合。树突细胞可通过各种方式用于癌症疫苗接种，包括：1.体内树突细胞捕获的非靶向肽/蛋白和基于核酸的疫苗；2.直接与抗树突抗体偶联的抗原组成的疫苗；3 .由体外产生的负载抗原的树突组成的疫苗。

因为外周血中含有大量的Monocyte且比较容易分离纯化，而且能够高效的在体外进行诱导分化，因而现在大部分的DC疫苗使用的均为Monocyte在体外分化而成的Mo-DC。主要方法就是使用磁珠或贴壁法分离外周血中的CD14+单核细胞，随后使用IL-4和GM-CSF进行诱导分化，最后通过TLR配体或细胞因子激活成熟。当然现在有很多研究表明Mo-DC与自然DC存在差异，直接使用外周血的DC能够起到更好的疫苗功能。