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干货,一文读懂抗体依赖细胞毒作用(ADCC)及相应个体推荐

【ADCC是现在很多抗体药物发挥药效的重要方式,相关实验也是研发人员经常接触的,虽然现在有基因改造的Jurkat细胞株,但在实际操作过程中仍旧离不开PBMC,毕竟其更能模拟人体内的ADCC效应。但使用PBMC,存在Fresh PBMC来源不稳定,使用不方便,个体差异巨大的问题。

本文详细介绍了ADCC的相关作用机理,常见的检测方法,并且最后推荐了已经经过很多制药客户验证的适合ADCC实验的冷冻PBMC批次,可以有效确保实验的稳定性


当抗体通过抗原结合部位结合肿瘤细胞表面抗原以及Fc部位结合免疫效应细胞表面FcR时,免疫效应细胞得到激活,杀死肿瘤靶细胞, 这 个 过 程 称 为ADCC。人 的 IgG抗体通常IgG1最高。 Fc受体主要 有3FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)FcγRIII (CD16) 。其中后面两种低亲和力的受体可以进一步细分为FcγRIIa(激活性受体)、FcγRIIb(抑制性受体)和 FcγRIIc(激活性受体),以 及FcγRIIIa(激活性受体)和 FcγRIIIb( 没有胞内区,通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞表面)。不同的免疫细胞种群表达特定的Fc受体,例如中性粒细胞通常表达FcγRIFcγRIIFcγRIIIb,而NK细胞只表达低亲和力的FcγRIIIaFcγRIIIa通常认为是引起ADCC的关键受体,所以虽然NK细胞,单核巨噬细胞和中性粒细胞都可以产生ADCC作用 ,但是NK细胞认为是其中最重要的细胞种群。激活的NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶等细胞毒颗粒直接杀死肿瘤靶细胞,同时也分泌IFN-γ等细胞因子和化学因子来调控其他免疫细胞。

虽然许多抗肿瘤抗体在体外都显示ADCC作用 ,但是 ADCC这一作用机制与临床有效性之间的关联还没有得到完全证实。Clynes等人通过比较几种临床有效的抗体对接种于野生型小鼠和FcγRII/III基因敲除小鼠体内的人异体移植肿瘤的疗效,对Fc受体相互作用的重要性进行了评价。这些抗体在FcγR基因敲除小鼠体内的疗效远不如野生型小鼠,但是在只敲除了抑制性FcγR的小鼠体内疗效得以保持甚至增强。这些结果表明抗体与Fc受体相互作用是抗体在小鼠体内抗肿瘤有效性的基础,并且对某些抗体在临床上的有效性也具有重要作用。在 对rituximab的临床研究中发现,某些淋巴瘤患者的治疗效果远远好于其他患者。后经分析发现,这些高应答个体患者都具有相同的Fc受体多态性。人的CD16蛋白由于在158位氨基酸是缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)而呈现两种多态性,CD16-158VCD16-158FCD16-158V与抗体Fc部位的亲和力高于CD16-158F带有CD16-158V/V纯合体的患者比带有CD16-158F/F纯合体以及V/F杂合体的患者对rituximab更敏感,其肿瘤治疗的预后也更好。这些研究表明抗体Fc部位和Fc受体的相互作用至少在一定程度上是rituximab临床疗效的基础,同时也显示了 ADCC的重要性。在transtuzumab治疗的患者肿瘤部位发现了明显的NK细胞浸润以及增强的淋巴细胞活性。后续研究表明,NK细胞在transtuzumab 介 导 的ADCC中起关键作用。transtuzumab治疗敏感的HER2/neu阳性早期乳腺癌患者较不敏感患者表现显著增强的ADCC,而且这个介导的细胞毒作用强度与肿瘤病灶的缩小具有显著的关联性。CD16-158V/V的乳腺癌患者对transtuzumab治疗具有较高的客观有效率以及无进展生存期


单克隆抗体介导的ADCC强弱跟许多因素有关,比如抗体与抗原的亲和力,抗体与 Fc受体的亲和力、肿瘤抗原的密度、肿瘤靶细胞的特性以及免疫效应细胞的特性等。 般情况下 ,肿瘤靶细胞与免疫效应细胞通过抗体的桥联结合越紧密ADCC作用越强。因此,对抗原或Fc受体亲和力高的抗体介导的ADCC作用更强。表达靶抗原高的肿瘤细胞对ADCC更为敏感,容易被ADCC作用所杀死。但是我们在实践中也发现一些高表达抗原的肿瘤细胞对ADCC表现出抗性,这可能与肿瘤细胞的本身特性有关,比如下调与免疫突触形成有关的黏附分子,上调与细胞修复有关的蛋白等。同 时,免疫效应 胞本身的特性也影响ADCC比如NK细胞表达的Fc受体的多态性,对免疫调节因子的反应性等。改造抗体,提髙其对抗原或Fc受体的亲和力,可以提高抗体介导的ADCC作用 ,这是提高抗体抗肿瘤活性的直接、快速和有效的一个途径。

提高抗体对抗原的亲和力可以通过体外亲和力成熟来实现,这一过程主要是在体外模拟体内抗体的亲和力成熟过程。具体的方法手段有很多,包括噬菌体、核糖体、酵母表面呈现 ,以及倾错PCR和链替换等,这里不一一详述。


提髙抗体对Fc受体的亲和力可以通过改造抗体Fc部位的糖基化和氨基酸序列来实现。位于IgG抗体CH2结构域297位的天冬酰胺是一个保守性的氨基酸,其糖基化对于抗体与Fc受体的相互作用很关键IgG-N297N-连接的低聚糖通常是一个复合型结构,由甘露糖化-壳二糖核心(Man3GlcNAc2-Asn)外加不等的平分型乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc) 、核心岩藻糖、非还原性末端Gal和唾液酸组成。对一系列截短糖基IgG的研究显示Fc部位低聚糖的α(1-6)结构的糖残基与CH2结构域内表面的非共价相互作用决定了蛋白-低聚糖复合物的整体构象。如果逐渐截短低聚糖组成,一个类似于马蹄型的结构就会显露出来。当低聚糖截短到三糖时,其结构完整性和功能性都下降。当进一步截短到只剩最初的N-乙酰葡萄糖胺残基时,其功能性完全丧失。核心β-甘露糖残基上的平分型GlcNAc对抗体的生物学活性,尤其是ADCC的影响比较大。从 N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶IIIGnTIII转染的CHO细胞中产生的抗体含有大量的平分型GlcNAc。这种抗体较普通抗体的ADCC活性强10倍 。过多的唾液酸残基降低抗体与Fcr/REIa及抗原表面的结合,从 而 影 响 ADCC活性。在所有的糖组分中,岩藻糖被认为是影响ADCC活性的最重要的糖。去掉岩藻糖可以显著提高抗体与FcγRIIIa的亲和力及ADCC活性。研究显示,不论抗体识别的抗原是什么抗体的种属来源和亚型是什么,其Fc部位的去岩藻糖化都可以提高ADCC活 性 高 至 100多倍,同时也提高了体内抗肿瘤活性。由于目前几乎所有商业化的治疗用抗体都是利用哺乳动物细胞大规模发酵产生而且α-16-岩藻糖基转移酶(FUT8) 是催化低聚糖岩藻糖化的关键酶。所以,抑制或者完全消除生产细胞株的FUT8活性 ,就可以很容易得到去岩藻糖化的抗体。目前巳经有研究小组获得了FUT8基因敲除的CHO细胞株。这一改造后的CHO细胞除了没有FUT8基因表达外,其他如细胞形态、生长动力学、蛋白产量等与野生型CHO并无不同。用 这种FUT8缺陷的CHO细胞产生的抗体不含岩藻糖残基 ,具有很强的ADCC活性。

目前,对于突变Fc部位的氨基酸序列以获得可以介导高强度ADCC的抗体研究得比较充分。通过引入不同的点突变改造人IgG Fc部位的氨基酸,再测定这些突变抗体的亲和力及介导ADCC的能力,研究人员初步绘制出了人IgG,抗体与不同的激活性Fc受体和抑制性受体FcγRIIb的结合图谱。当 Pro238Asp265Asp270Asn297(丧失糖基化)和Pro329氨基酸残基被突变成为丙氨酸时,IgG1于所有FcR的亲和力都下降。所有这些氨基酸残基都位于IgG CH2结构域靠近CH1CH2铰链区。这一区域连同其前端的铰链区共同构成IgG1Fcγn 的结合部位。对于FcγRIIIa而言 ,拥有3个突变(S298AE333AK334A) 的抗体显示最强的结合能力和介导ADCC的能力。另外一个研究小组应用酵母呈现系统筛选了大量Fc突变体,发现一个拥有5个突变 (F243LR292PY300LV305IP396L) 的突变体对FcγRIIIa的亲和力提高了 10倍 ,同时也具有更强的ADCC活性。基于Fc-FcγR结合面的结构信息,运用计算设计和高通量筛选评估技术发现, IgG1 Fc突变体(S239DA330LI332E)FcγRIIIa的亲和力提高了100倍 ,但是对抑制性受体FcγRIIb的亲和力提高有限。因此,这一突变抗体在体外和食蟹猴体内都介导很强的ADCC活性。

通过对抗体的改造获得具有更强ADCC活性的强化抗体, 具有显著的临床应用价值。一方面,一些原本对野生型抗体不敏感的抗原低表达肿瘤对强化抗体治疗敏感。另一方面,带有FcγRIIIa 158F多态性的低应答患者在使用强化抗体时可能产生有效应答。同时,强化抗体的使用剂量也可以缩减,同样可以达到髙剂量野生型抗体的疗效。这可以大幅减低抗体的使用剂量,降低医疗成本。然而 ,强化抗体也会产生副作用,比如一些低表达抗原的正常组织细胞也会受到强化抗体的作用,但不会受到野生型抗体的作用。不论是点突变改变氨基酸,还是改变糖基结构,都是人工改变了野生型抗体的结构,增大了应用于人体时导致抗抗体产生的可能性。



体外检测ADCC效应有以下几种方法。


1.1通过检测乳酸脱氢酶的释放,检测靶细胞的死亡量

此方法利用荧光分析法检测多孔板中死亡细胞的数量。它通过测定损坏的细胞膜中释放出来的乳酸脱氢酶(LDH)。产生的荧光量与裂解的细胞数量成正比。酶学反应对正常的健康细胞无任何损伤,因此检测可在正常细胞与死亡细胞的混合物中完成。这是传统的用于检测ADCC的方法,操作比较简便,但缺点是靶细胞没有被标记,检测结果不能区分靶细胞和效应细胞的LDH释放。

操作过程:准备好靶细胞加入到96孔反应板中,然后再加入按比例稀释好的阳性对照抗体和样品,孵育一定的时间,将准备好的效应细胞(NK92/CD16A细胞或者从血里提取的PBMC)加入到对应孔中孵育一定的时间,孵育完后酶标仪读取荧光,对于不同靶细胞,不同的抗体的LDH检测方法:效应细胞和靶细胞的比例以及孵育时间都需要重新优化。


1.2 BATDA 标记靶细胞,通过检测荧光的强弱,检测靶细胞的死亡数量

 此方法是用荧光增强配基-BATDA 标记靶细胞,疏水的配基BATDA能够自由透过细胞膜,进入细胞膜后BATDA被水解形成亲水的配基TDA,不易透过细胞膜。当靶细胞被效应细胞裂解后,TDA漏出细胞膜,加入Europium Solution,形成强荧光的稳定金属螯合物:Eu-TDA。这是一个时间分辨荧光强度实验,所以需要测TRF(Time-Resolved Fluorescence)。


图3:BATDA 标记细胞及检测原理

 图4: BATDA 标记靶细胞及其检测ADCC 的 基本过程


此方法的操作方法与检测乳酸脱氢酶的方法的类似,只是多了一步靶细胞的标记和洗涤的过程。

此方法的优点是灵敏度高,荧光信号稳定,非放射性,缺点是操作比较复杂,由于标记靶细胞会对细胞有一定毒性,对于一些比较敏感的靶细胞被标记后发生大量自我死亡。对检测杀伤产生影响。


此方法需要优化的条件:不同靶细胞BATDA 标记的时间,不同靶细胞标记所需要的BATDA的浓度;不同靶细胞不同抗体:效应细胞和靶细胞(NK92细胞或者PBMC)的比例,效应细胞与靶细胞,抗体的孵育时间需要优化。


1.3 Calcein-AM 标记靶细胞,通过检测荧光的强弱,检测靶细胞的死亡数量

Calcein-AM 也是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,它在Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。Calcein 标记后可以用两种方法检测杀伤效果,一种是Calcein-AM release assay,用酶标仪读取死亡细胞释放至上清的荧光量即靶细胞的死亡量;另一种是 Calcein-AM retention assay,用流式细胞仪检测滞留在靶细胞内的Calcein 绿色荧光信号的强弱从而检测活细胞的数量。


1.3.1 Calcein-AM release assay,用Calcein-AM标记靶细胞后,加入抗体和效应细胞,孵育一定时间,用酶标仪读取荧光。每个细胞不同的抗体,效应细胞和靶细胞的比例以及孵育时间都需要重新优化。此方法的优缺点以及需要优化的条件同BATDA 标记靶细胞的方法一样。

1.3.2 Calcein AM retention assay

Calcein AM retention assay 前期的标记靶细胞及与抗体效应细胞的孵育的操作同release assay一样, 只是最后通过流式细胞仪检测。


1.4 ADCC 报告基因生物活性检测

ADCC报告基因生物活性检测即ADCC Reporter assay,它的操作过程和前面提到的几种ADCC的方法一样。待检测的抗体和表达相应靶点的靶细胞结合。然而在检测报告基因的实验里,需要用到工程T淋巴细胞-表达FcγRIIIa 受体的Jurkat 细胞而不是NK细胞。报告基因检测法的优点是,效应细胞Jurkat 细胞培养简单,实验程序操作简单,实验稳定性好,背景低等。缺点是它不是模拟体内ADCC作用过程,此方法可以用作前期的抗体筛选阶段,但是到后期确定抗体功能,还是需要效应细胞为PBMC的方法,更能模拟人体内ADCC作用过程。在这个过程中,Fc段与Jurkat 细胞上的FcRIIIa受体结合,FcRIIIa受体的活化能够引起nuclear factor of activated T-cell(NFAT)信号通路的活化,启动荧光素酶报告基因的表达。一旦靶细胞被裂解,荧光素酶和荧光素和ATP相互反应,产生一种稳定光信号。这个实验是一个"加样-混合-读数"的检测模式极大减少了操作步骤,不需要离心和转板。


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4. 此个体人种为亚裔,24岁,BMI 27, 无吸烟史,无用药史;

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参考文献

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20190410


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