抗原介绍--从六个方面完整阐述抗原

2019-03-07 19:38 儒百严国樑

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【秉着宁缺毋滥，只做精品的态度，我司产品线从原先的PBMC开始慢慢扩展了阳性对照抗体，阴性对照抗体和重组靶点蛋白，在这个过程中，也逼着自己慢慢去学习新的知识，虽然大块头的教科书和最新的英文文献已经很难静得下心来看进去，但确实感觉微信上的各种公众号良莠不齐，知识碎片化过去严重。因而小编借着写公司公众号的机会，一方面整理自己从各类文献，文章中看到的相关信息，围绕着肿瘤免疫每次啃个一小点，另一方面当然也是介绍下我司的产品在其中的用途。本次整理了一下抗原的相关知识，因为篇幅比较长，本来想分割成几篇来发，不过考虑到完整性还是在一篇推文中都上传了】

抗原（antigen，Ag）是一类能刺激机体的免疫系统，引起机体免疫应答、产生抗体和致敏淋巴细胞等，并且能与相应的抗体或者致敏淋巴细胞在体内或者体外发生特异性结合的物质。在单抗制备中可以笼统的理解为，能与相对应的抗体发生特异性结合的物质都可以认为是抗原。

这里有两个概念容易被混淆，抗原和免疫原。小分子物质，比如所三聚氰胺，它可以作为抗原与之相应的抗体发生特异性的结合反应，但是就三聚氰胺本身，它是不能刺激机体产生抗体的，但它是抗原，为了得到三聚氰胺的抗体，就需要对其进行加工修饰，使其能够刺激机体产生免疫应答反应，这个经过修饰的三聚氰胺就是免疫原了。抗原包括免疫原，但抗原不等于免疫原。为方便起见，下面谈到的抗原均指的免疫原。分以下六个部分来介绍抗原。

1.抗原的特性

2.抗原递呈与加工

3.主要组织相容性复合体（MHC）

4.抗原决定簇

5.决定免疫原性的因素

6.抗原制备方法分类

抗原的特性

免疫原性

从抗原的定义中可以得知，首先，抗原是可以刺激机体发生免疫应答反应，这里说的免疫应答反应就包括产生抗体、产生致敏的淋巴细胞等等。这就是抗原的第一特性，免疫原性。

异物性

抗原是相对来说的，是相对于某一个机体来说的，某一种物质来源于物种A，对于这个B物种的动物来说可以称作是抗原，可以刺激该物种的机体产生免疫反应啥的，但是对于A物种的动物，该物质就不能刺激它产生免疫反应了，更不用说什么抗体特异性结合。因此，能叫做抗原的物质，一定有一个重要的性质，那就是异物性，就是相对于该机体来说的非己物质。

一般来说，抗原与机体之间的亲缘关系越远，组织结构差异性就越大，异物性就越强，其免疫原性就越强，越容易刺激体积产生免疫应答反应。

还有一个值得注意的是同种异体的不同成分，这个与我们生活相关，不同血型的红细胞（ABO血型抗原等），皮肤移植、器官移植的排斥反应等，虽说是同种的，但是个体差异在那，还是会有免疫反应。

启示：如果要制备小鼠体内某一蛋白的抗体，最好就选择兔子或者山羊之类的作为宿主；如果要制备人体内某一蛋白的抗体，那我们就可以用小鼠来做宿主；当需要对某一半抗原进行修饰连接载体蛋白，这就要根据宿主来选亲缘关系远的载体蛋白了，时下用的最多的是钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）等，这些蛋白与小鼠亲缘关系远。

特异性

所谓特异性是指物质之间的相互吻合的针对性，如针对性强，彼此之间完全或者高度的吻合，特异性就高，相反就低。

抗原的特异性包括了免疫原性和免疫反应性的特异性，免疫原性的特异性指的是抗原刺激机体后引起的免疫应答是高度特异的，比如说你用A蛋白去刺激小鼠，那么小鼠免疫系统采取的措施都是针对A蛋白的，不会对B蛋白、或者C糖蛋白产生作用。免疫反应性的特异性指的是某一特定的抗原，只与其相对应的抗体或者致敏淋巴细胞发生特异性的结合而出现反应。

其实在单抗制备当中，往往会出现制备的针对A蛋白的单抗，怎么会对B蛋白也有一点反应呢！！！这里就要引入一个抗原决定簇的概念了，有时候也称作抗原表位，存在于抗原中的抗原决定簇是决定抗原特异性的结构基础，之所已会出现制备的A蛋白的单抗也会与B蛋白有点反应有点瓜葛纠缠不清，那是因为A、B两个蛋白可能有几个相同或者相似的结构表位，也就是他们或许有同样的抗原决定簇。

这也给了我们启示，当你分析抗原的时候，尽量制备针对该抗原独有的表位的抗体，这样才能保持你制备的单抗的高度特异性，尤其是制备某蛋白家族中的某一个蛋白的单抗。抗原决定簇和抗原的特异性是分不开的。

完整性

完整性指的是，抗原在经过非消化道途径进入机体（皮下注射、吸入、伤口处进入等），并接触淋巴细胞，这才能成为良好的抗原。从你嘴里吃进来的一堆蛋白质，在胃里、小肠等消化一通后水解成了氨基酸等，这就破坏了抗原决定簇，不再具有免疫原性。

抗原递呈与加工

抗原在经过正当的途径（不被消化的方式）进入体内，是要被抗原递呈细胞加工后再递交给T细胞，抗原分子能否被有效的加工和递呈，决定了这一分子的免疫原性。

所谓递呈就是抗原递呈细胞摄取抗原，在细胞内被降解成抗原肽，再通过MHC分子将抗原肽递呈于细胞表面，将其给予T细胞或者B细胞识别。

抗原递呈细胞（antigen-presenting cell,APC）：表达MHC和协同刺激分子，能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞。此类细胞能辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并对抗原产生应答。有专职APC和非专职APC之分，专职APC有：树突细胞、巨噬细胞、活化的B细胞；非专职APC有：内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、脑内小胶质细胞等。抗原递呈细胞在整个免疫环节中相当于中间人一样，把抗原引进来处理一番，以全新的面貌展现给T细胞或者B细胞。

树突细胞（DC）

由美国学者Steinman在1973年发现的，因为长的像伸出的树枝样突起而得名。主要是通过巨吞饮、内吞作用、吞噬作用三种方式来摄取抗原。它是目前所知到的机体内功能最强的APC，抗原递呈功能是巨噬细胞的10-100倍。

巨噬细胞（Macrophage)

它是由血液中的单核细胞分化而来，单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞，它的主要功能是固定或游离的细胞形式对细胞残片以及病原体进行吞噬作用，并激活淋巴细胞及其他免疫细胞，对于病原体发起攻击。它跟树突细胞不同，它不可以活化未致敏的T细胞，而树突细胞可以。MHC分子和协同刺激分子主要在游离状态细胞表达。

B细胞

这个我们也熟悉，在抗原递呈过程中，它主要是加工和递呈可溶性抗原。通过胞饮和受体介导两种方式摄取抗原。通过它自身特有的BCR（是存在于B细胞膜表面的免疫球蛋白，并非由抗原刺激产生，是在B细胞发育过程中出现在细胞膜上的结构）高效的摄取抗原，具有浓集抗原的作用。B细胞表达MHC II分子，但是不表达协同刺激分子。

我们制备单抗，拿抗原来免疫小鼠，主要是通过这三种细胞来呈递。大家都知道，抗原可分为外源性和内源性抗原，外源性抗原就是从体外摄取进来的并非自身的物质；内源性抗原是自身的破碎细胞残片啊什么的。不论什么抗原，被APC摄取后会在细胞内被降解，将蛋白质类的抗原分解成大小不同的肽段，再于MHC分子相结合表达到细胞表面。下图明确比较了APC对内源性和外源性抗原的处理方式。

好，大家肯定注意到了，在抗原递呈过程中，还有一个重要的物质就是MHC分子，还有I类和II之分。这很重要，是它与抗原肽结合表达在细胞的表面供给T细胞检查、扫描、比对，是不是自身的物质，不是的话就启动免疫系统，发起攻击。下面来介绍一下MHC和MHC分子。

主要组织相容性复合体（MHC）

其实这个概念大家肯定都不陌生，知道这是器官移植手术中的一个重要的鉴定指标，两个人能不能进行器官移植，主要取决于这个MHC。主要组织相容性复合体（MHC）是一个高度多态性的基因群，注意，它是一个基因群，所以MHC的主要成分在是脱氧核苷酸，其表达的产物分布在各种细胞表面，也就是MHC分子，主要成分是蛋白质了，也可以叫做MHC抗原，它是移植排斥反应的主要决定因素，也就是说，两个个体能表达相同MHC分子，其就可以接受彼此的器官移植，相反，就会出现强烈的移植排斥反应。血缘关系近的，MHC分子的相似程度肯定就高了，因为等位基因的交叉互异啊什么的就少了。

MHC基因群是40年代进行个体间组织移植的时候发现的，这个时候发现的还是它的移植相关的作用，大约在20年后，人们又发现了MHC在免疫应答中的重要作用。前面已经提到，MHC分子以复合物的形式将抗原性多肽提供给T细胞，这样T细胞才能对外源性的抗原发挥作用。MHC基因的产物分为两种类型：MHC I类和II类分子。MHC分子是T细胞识别抗原的必需成分。在说一点，人类与MHC功能相同的基因群不叫做MHC，通常被称为HLA，人类白细胞抗原。

MHC I 类分子（结合内源性抗原）

所有的I 类分子中，都包含了两条不同相连的多肽链，一条为α链或者称作重链，因为其分子量较大，人类的约为44kDa，小鼠的约为47kDa，该条链是由MHC编码的，另一条是非MHC编码的β链，人类和小鼠均为12kDa。α链由一个40kDa的核心多肽形成，N端在细胞膜外面，连接有寡糖（人类是一个，小鼠是两个），α链有3/4在胞膜外，跨膜区为一疏水的片段，在细胞膜内为30个氨基酸残基的碳末端。β链与α链在细胞膜外部分非共价结合，不跟细胞直接相连。

我们可以把I类分子分成四个部分：肽结合区，α链在这个区域里由两个α螺旋和一个β折叠结构，能形成凹槽，与抗原肽相结合；Ig类似区，这个区域里包含有一段α链和β2微球蛋白，两者非共价结合；再下面就是跨膜区，包含25个疏水的氨基酸残基；胞内区，α链羧基末端含有30个氨基酸残基。MHC I类分子的肽结合区凹槽适于结合易弯曲蛋白的9-11个氨基酸片段。该凹糟比较小，很难结合完整的天然蛋白，必须经过处理，转换成小的片段才行。

MHC II 类分子（结合外源性抗原）

MHC II类分子是由两条非共价相连的多肽链组成，由图可知，两条链的整体结构相似，α链糖基化较为广泛，一般在32-34kDa。与α链相比较，β链稍短，一般在29-32kDa，两条多肽链在N端均含有寡糖，每条链的2/3在胞外区，都是有MHC基因编码的。与I类分子相同，也可以分为四个区域：肽结合区、Ig类似区、跨膜区、胞内区。II类分子的肽结合区也是由α螺旋和β折叠组成，形成裂缝的侧面和底面，与I类分子不同的是其裂缝末端是开放的，这样就可以允许抗原肽从中伸出来，这也就说明了，与II分子结合的抗原肽氨基酸数目在10-30以上，一般为15个。II类分子主要是结合外源性的抗原。

抗原决定簇

抗原决定簇是由一段连续的序列（指的就是位于分子表面或内部的表位）或者不连续的三维结构组成的，是抗原分子特异性的基础，是与抗体发生结合反应的部位。不难理解，一个抗原可以有多个不同的抗原决定簇，也可能有几个相同的抗原决策（虽然这种可能性很小），当然，分子量越大其抗原决定簇的个数相应的就会越多。

抗原决定簇的结构和构象

前文已经说到了，抗原肽是经过MHC分子递呈给Ｔ细胞和B细胞的，他们识别的是线性的抗原肽，这也就不难理解，大部分的抗原决定簇都是线性结构的，这是一种，称为线性决定簇，一般有6个氨基酸的长度就可以与抗体形成特异性的结合。还有一种是抗原分子的空间构象，这一类抗原决定簇可以直接被B细胞识别处理，这一类的结构是蛋白质分子折叠时由线性的氨基酸序列的相隔的氨基酸残基而形成的空间构象，称为构象决定簇。另外一种就是隐藏在分子结构内部的，在天然蛋白质分子中不存在或者不被暴露，经过特定的蛋白质酶水解后才形成或暴露出来，称为新抗原决定簇。B细胞受体（BCR）或抗体识别的抗原决定基，可为构象性或线性表位。T细胞识别的抗原决定基，为线性表位。在单抗制备中，最好的是线性决定簇，抗体应用的时候也不用对抗原进行特殊的处理，构象决定簇的抗体在做抗原变性实验后的验证时就不行，比如说WB，电泳已经破坏了分子的空间结构，抗体无法或者很弱的结合抗原分子，对结果造成影响。针对新抗原决定簇的抗体，在筛选的时候就很难筛选到，因为做ELISA检测时，抗原不会做太多的蛋白水解处理，这一类的抗体几乎筛选不到。这里还有一点要注意，半抗原，就是小分子抗原，具有镜像结构的小分子，制备其抗体，左旋和右旋的抗体也不一样哦，这也有区别的，识别左旋分子的抗体不一定识别右旋分子，抗体的特异性太强大了。

抗原决定簇的大小

抗原决定簇的大小其实是受到抗体分子上与抗原结合位点的大小决定的，抗体只能结合12大小的抗原，那么抗原决定簇大小最好是12了，对吧，这是举个例子。糖基类抗原决定簇为6个糖基大小最好，蛋白质类的抗原决定簇由5-7个氨基酸组成，核酸类抗原决定簇由5个核苷酸组成。这也就提示我们，在制备某一蛋白抗体的时候，其特异性的氨基酸序列刚好在7个以上，就可以从中选取一段亲水性好、靠近两端的序列作为决定簇。制备几个或者十几个氨基酸的抗体，需要偶联载体蛋白，保证免疫原分子的分子量。

抗原结合价

这里指的是，抗原分子中能与抗体分子结合的抗原决定簇的总数。这个不难理解，一个100氨基酸的多肽，根据蛋白质抗原决定簇大小来推算，那么就有14-20个左右的不重复的决定簇，但是实际值比这要小，氨基酸残基的亲水性疏水性也是决定其能否成为决定簇的一个重要因素，几个连续的疏水残基在一起，那么这一段成为决定簇的可能性就很小了，还有就是多肽会有折叠等，也会减少决定簇的理论数。小分子半抗原都只有一个抗原价，一个分子结合一个抗体吗，牛血清蛋白有18个决定簇，那么它的就有18个抗原结合价。

抗原决定簇的分类

抗原决定簇的分类无非就是根据决定簇能否直接淋巴细胞识别，识别了以后是否会对旁边的决定簇产生影响，哪些决定簇容易被识别，哪些不容易被识别，抗原分子类型等特性来分类，没啥好讲的。单抗制备中，最重要的就是抗原，对你的目标抗原进行分析，设计相对性的免疫原，免疫动物。

决定免疫原性的因素

异物性

免疫系统最大的特点就是在于能够识别自身和非己的物质，从而产生应对措施。这就不难理解要想让免疫系统发功，就一定到用非己物质来刺激它，来调戏它。你家里的亲人，你亲妈不会排斥你，不会不要你，对吧，不要的，不喜欢的肯定是外来的碧池。异物性是能够刺激免疫系统产生应答最基础的特征。单抗制备中，常用的是小鼠，所以你制备小鼠相关物质的抗体就不要选小鼠作为宿主啦。原则就是选择物种进化距离越远的越好，物种跨度越远越好。

相对分子质量

作为完全抗原，其分子质量最好在10kDa以上。一定范围内，分子量越大免疫原性越强。因为太小了，结合上面提到的抗原递呈，MHC分子根本呈递不了。大分子胶体具有复杂的化学结构，是良好的抗原，一般在100个以上的氨基酸组成的蛋白质就是大分子胶体。分子量越大的物质，其抗原决定簇就会越多，就会对淋巴细胞产生更加有效的刺激作用；还有，大分子胶体物质的化学结构稳定，不容易被破坏和清除，能够在机体内停留较长时间，产生持续的刺激。

抗原化学组成足够复杂

由单一氨基酸组成的聚合物，尽管分子量足够大，但也仅仅是分子量大而已，免疫原性很low。当然，含有苯环等残基的氨基酸越多越好，还有，亲水性的氨基酸越多也是极好的，亲水性的氨基酸组合在一起更有可能成为抗原决定簇。所以在设计抗原的时候，在可选范围内，肯定是挑选这一类的氨基酸了，对吧。

可递呈性和易接近性

什么是可递呈性呢，说白了就是能被APC细胞降解，并且能与MHC分子结合呈递给淋巴细胞。APC吞噬大分子抗原后，其溶酶体就会对其降解，如果组成抗原的氨基酸构型是D型，并非L型，就很难被降解，免疫原性就降低了。易接近性则说的是抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。易接近性的难易程度常与这些化学基团在抗原分子中分布的部位有关，如存在于抗原分子表面的化学基团易与淋巴细胞抗原受体结合，免疫原性强；若存在于抗原分子的内部，则不易与淋巴细胞表面的抗原受体接近，而不表现免疫原性。

宿主的遗传背景

遗传背景说白了就是不同MHC背景，具有不同MHC背景的实验动物对于同一抗原产生的应答具有明显的差异。主要体现在不同的MHC等位基因分子，所呈递的抗原肽可激活不同的T细胞克隆。单抗制备中常用的小鼠有：BALB/c品系、C57BL/6品系、C3H品系、ICR小鼠、SCID小鼠、129小鼠等。其中最常用的是BALB/c品系和C57BL/6品系。

抗原的免疫途径和剂量

同一种抗原，不同的免疫方式，其带来的免疫结果也是不尽相同的。静脉注射抗原先进入脾脏；皮下注射，抗原首先进入局部淋巴结。这些器官中淋巴样细胞的群体结构不同，会影响随后的免疫应答格局。还有，在数周内，反复注射同一抗原比一次性注射效果要好。剂量的话，这个根据不同的抗原来源不尽相同，蛋白质之类抗原一般每次100ug每只小鼠，人工抗原可以适当加到150ug每只。

免疫佐剂

佐剂是一类物质，能与抗原同时注射到机体，能够非特异性的增强机体对抗原的免疫应答能力，这类物质就成为佐剂。佐剂能延长抗原的半衰期，降低抗原的直接作用毒性，并使抗原在免疫部位缓慢、持久释放，提高巨噬细胞和免疫活性细胞的作用。目前市面上常用的就是西格玛的弗氏佐剂，它是将液体石蜡和羊毛脂按照一定的比例混合，这是不完全佐剂。向其中加入灭活的人结核菌或卡介苗，就是完全佐剂。加入这些物质可以诱导免疫反应发生质的变化，大大的提高了抗原的免疫原性，还可以改变产生的抗体类型，并且促使迟发型超敏反应的出现或加强。市面上还有一种佐剂，直接与抗原混合后注射小鼠大腿肌肉进行免疫。佐剂在使用的时候要注意的就是与抗原的乳化这一步骤，要想获得好效果，必须要乳化完全，方法有很多种，比如抗原和佐剂混合后，用组织匀浆破碎仪搅拌，很快就能乳化好，节省时间。

抗原的分类

根据单抗制备方法不同来对抗原进行分类，然后简单的说明一下。

天然类

这一类抗原就很简单了，就是从天然的原材料里面提取出来的，制备其抗体也是最简单的。主要有天然蛋白质、菌体、细胞等。最主要的一点就是要保证其抗原的纯度，抗原杂质里面不能有热源等物质，一般能有50%以上的纯度就可以。因为是天然的蛋白质，制备抗体也是用于与天然的蛋白质相互作用，因此就相对简单。获得了抗体，WB或者免疫组化进行验证就行。当然了，这一类抗原的纯化方法越温和越好，尽量保证天然抗原的原有物理性质，抗原决定簇等不受到改变。

重组蛋白类

有一些天然的蛋白质类抗原很难纯化，但也需要制备其抗体啊，怎么办，只能先根据其氨基酸序列，构建质粒转染细胞，表达带有标签的重组蛋白，然后纯化，拿他免疫小鼠，制备抗体，回过头来再对抗体进行鉴定，鉴定其会不会识别天然样品中的目标蛋白。这一类的抗原，也主要是纯化后不能有热源，还有保证纯度。虽然重组的蛋白与天然的蛋白类抗原在结构等方面有一定的区别，但这样也是可以制备出识别天然蛋白的抗体。

多肽片段类

现在实验要求高，所需要的抗体要求也高，同家族的蛋白都必须要用抗体区分开，这就要制备高度特异性的抗体了。同家族的蛋白或许只有简单的一段几个氨基酸序列不同，那么一段特异性的序列就是突破口，制备其抗体。弄清楚这一段氨基酸序列，根据大小，挑选适当的长度（根据天然蛋白的结构特征，挑选暴露在分子结构外部的序列），合成该一段多肽片段，偶联大分子载体，制备人工抗原。

小分子抗原

这就小的化学物质这一类的抗原了，什么三聚氰胺，盐酸克伦特罗，地高辛等，还有一些小分子毒素等，黄曲霉毒素等，这些小分子抗原就需要进行修饰，然后偶联蛋白质载体，制备人工完全免疫抗原免疫动物。这一类抗原，要注意的就是小分子与载体蛋白的偶联比，以及纯度，还有就是小分子与载体偶联臂的长度。