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No Worry about the Cells Again

荧光染料CFSE标记实验

荧光染料CFSE, 也可称为CFDA SE(5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester) 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂,是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

当细胞进行分裂增殖时,具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中,这样与第一代细胞相比,其荧光强度便会减弱至一半;以此类推,分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下,采用流式细胞仪检测分析,通过检测到细胞荧光强度不断的降低,进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

材料

1. PBMC

2. CFDA SE 细胞示踪剂试剂盒 (分子探针) 或类似试剂

3. 抗原

4. PBS

5. 建议用2%AB血清IMDM培养基用于人PBMC的培养

步骤

1. 将用于标记的PBMC细胞调整至107/ml浓度;

2.将 90 ulDMSO加入到一管的CFDA SE中并混合好,制成10mM的溶液;

3.移取10ul溶液并溶解于10ml的PBS中,将溶度调整至10uM

4. 1:20将CFDA调整至0.5uM备用;

5. 将细胞离心200g,10min;

6. 去除上清,将0.5uM的CFDA加到细胞沉淀中;

7. 在37°C 时孵化 15分钟, 使染料扩散到细胞中

8. 离心去除细胞悬液, 重新将培养基加入到细胞沉淀中, 在37°C 孵育30分钟

9. 孵育后, 以 200g的速度再次离心细胞10分钟

10. 去除上清液, 重新将培养基加入到细胞沉淀中,调整细胞浓度至 5 x 106/ml;

11. 24孔板中加入细胞悬液,1ml/孔;

12. 添加相同体积的抗原、丝裂原或试剂进行检测

13. 在5% CO237°C 条件下培养4-7天。对于丝裂原, 如PHA, 4天是最佳的, 但对于其他抗原, 7天的孵育能够更好的激活细胞

14. 在孵育结束时, 收集细胞。在FL1 通道中检测CFDA, 在 FL2 或 FL3 中检测viability stains or antibody conjugates

控制

1. 设置阴性对照:不含抗原的

2. 必须有未被标记的细胞以设置背景荧光或补偿。

3. 查看下面的样品增殖(以Treg为例)数据。

CFSE Data Example

Our experience with CFSE is that polyclonal stimuli such as PHA or anti CD3/anti CD28 will result in distinct generations of T cells, but antigen-specific stimulation shows the stimulated population at one level of division. This is shown in the figure below.

In all plots, the x-axis is CFSE fluorescence and the y-axis is staining with anti CD4 phycoerythrin. The upper left plot is an unstimulated CFSE-labeled culture, the upper right is a culture stimulated with tetanus toxoid, the lower left plot is stimulated with Astarte’s CMV antigen, and the lower right plot shows a polyclonal stimulation with PHA.


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