Schbio Biotech

Treg抑制实验

文章附图

材料


PBMC

Treg细胞

Anti-CD3

CFSE

PBMC培养基

Anti-CD8(荧光素标记或其余可用于FACs检测的标记)


步骤


1.按照我们的标准程序解冻PBMC,并用CFSE标记细胞(见CFSE标记实验protocol

2.解冻Treg细胞,调节细胞浓度至106/ml

3.Treg细胞以100uL/孔加入到96孔板

4.CFSE标记的PBMC调整至5 x 106 /ml,并在96孔板上每孔添加50 ul

5.anti-CD3稀释至4 ug/ml,并在96孔板的每孔中添加50 ul

6.37°C6%的二氧化碳下培养4-5天。

7.收集细胞,用Anti-CD8染色。


9.CD8+细胞群进行流式细胞仪门控分析。


注意点


1.    对照措施应包括:未添加抗CD3Tregs的单独的CFSE标记的PBMC,以及添加AntiCD3CFSE的标记PBMC,但没有Tregs

2.    没有anti-CD3PBMC不会增殖,但会提供未增殖细胞的荧光测量背景。

3.    具有抗CD3PBMC将具有离散的荧光强度峰值,标记每一次细胞分裂。在没有添加TregsPBMC中,可以很容易地看到其中的五到六个峰值。当更多的TregsPBMC一起培养时,峰值数量减少,更多的细胞保持在未分化状态;

4.    对于小鼠Tregs,使用脾脏细胞而不是PBMC。小鼠脾脏中T细胞的比例低于PBMCT细胞的比例。将每孔脾脏细胞数增加到500000个,以确保足够的CD8+细胞用于分析。可能还需要增加Treg数量。

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